Vedci vkladajú veľké nádeje do technológie CRISPR / Cas9, ktorá umožňuje vysoko presné zmeny v genómoch živých organizmov vrátane ľudí. Publikované sú všetky nové vedecké články popisujúce rôzne typy systémov CRISPR, ako aj ich modifikácie. „Lenta.ru“hovorí o objavoch v tejto oblasti, ktoré sa dosiahli v roku 2016.
Tisíce z nich
CRISPR / Cas9 je bakteriálny adaptívny imunitný systém, ktorý umožňuje mikroorganizmom bojovať proti vírusom. Skladá sa z spacerov - úsekov DNA zodpovedajúcich určitým fragmentom (protospacerom) DNA infekčného agens. Medzikusy kódujú špecifické molekuly crRNA, ktoré sa viažu na enzým Cas9. Výsledný komplex sa pripája k reťazcu DNA vírusu a Cas9 funguje ako nožnice, ktoré ho strihajú.
CRISPR / Cas9 je v skutočnosti iba jedným z mnohých podobných systémov, ktoré majú baktérie a archaea. Vedci ich delia do dvoch tried. Prvá trieda obsahuje systémy CRISPR typu I, III a IV a druhá - II a V. Typ II obsahuje proteín Cas9 zapojený do získavania nových spacerov, akumulácie crRNA v bunke a štiepenia DNA. V iných systémoch sa na tieto účely používajú multiproteínové komplexy. Vďaka tomu je typ II najjednoduchším typom systému CRISPR vhodným pre potreby genetického inžinierstva.
Typy je možné následne rozdeliť na podtypy podľa toho, ktoré ďalšie gény sú spojené s CRISPR. Napríklad systémy IIA obsahujú gén csn2, ktorý kóduje proteín, ktorý sa viaže na DNA a podieľa sa na získavaní spacerov. V systémoch IIB chýba csn2, ale existuje gén cas4, ktorého funkcia je stále neznáma, a systémy IIC neobsahujú ani csn2, ani cas4.
Poklady vo vnútri baktérií
Propagačné video:
Všetky známe systémy CRISPR objavili vedci v baktériách pestovaných v laboratórnych podmienkach. Existuje však obrovské množstvo nekultivovaných mikroorganizmov, medzi ktoré patrí archaea aj baktérie. Zvyčajne žijú v extrémnych podmienkach - minerálne pramene alebo toxické vodné útvary v opustených baniach. Vedci však od nich môžu izolovať DNA a identifikovať v nej konkrétne oblasti. V novom článku publikovanom v Nature 22. decembra genetici z Kalifornskej univerzity v Berkeley dekódovali genómy z prírodných mikrobiálnych spoločenstiev a objavili ďalšie variácie systému CRISPR.
Bakteriofág - vírus, ktorý infikuje baktérie
Obrázok: Giovanni Cancemi / Depositphotos
Vedcom sa podarilo zistiť, že niektoré typy málo študovaných archeo-podobných nanoorganizmov ARMAN majú aj CRISPR / Cas9, hoci sa predtým verilo, že ich majú iba baktérie. Je potrebné poznamenať, že tento systém zaujíma medzipolohu medzi podtypmi IIC a IIB a môže slúžiť ako obrana proti parazitickým „skokom“génov (transpozónov), ktoré vstupujú do mikroorganizmu z iných archaeí. Pokus o reprodukciu aktivity archaeálneho CRISPR / Cas9 v E. coli (Escherichia coli) neviedol k ničomu, čo naznačuje existenciu niektorých ďalších špecifických mechanizmov regulujúcich systém.
Nové typy systémov v rámci druhej triedy, CRISPR / CasX a CRISPR / CasY, boli tiež identifikované z baktérií žijúcich v podzemných vodách a sedimentoch. Systém CRISPR / CasX obsahuje proteíny Cas1, Cas2, Cas4 a CasX. Posledný uvedený, ako ukazujú experimenty na E. coli, sa vyznačuje nukleázovou aktivitou, to znamená, že je schopný štiepiť cudziu DNA, ako je Cas9. Stáva sa to však iba vtedy, ak je sekvencia TTCN pred protospacermi, kde N je ktorýkoľvek zo štyroch nukleotidov. Takéto sekvencie sa nazývajú PAM (motív susediaci s protospacerom - motív susediaci s protospacerom). Systém CRISPR / Cas9 má tiež svoj vlastný PAM - NGG, ktorý by mal byť umiestnený za protospacerom. Okrem toho je CRISPR / CasY schopný štiepiť DNA, ak je v blízkosti cieľového miesta sekvencia TA PAM.
Aký je prísľub tohto objavu? Faktom je, že detekované systémy sú najkompaktnejšie v súčasnosti známe. Podľa vedcov malé množstvo proteínov potrebných na ich prácu robí z CRISPR / CasX a CRISPR / CasY pohodlné nástroje na úpravu DNA. Okrem toho metagenomický výskum, pri ktorom sa študuje DNA získaná z prostredia, odhalí ďalšie typy systémov CRISPR, ktoré sú užitočné pre genetické inžinierstvo.
Cesta k dokonalosti
Samozrejme existuje alternatíva k hľadaniu systémov CRISPR v prírode - vylepšenie už existujúcej technológie CRISPR / Cas9. Napriek svojej vysokej presnosti robí chyby tým, že rozrezáva DNA na nesprávnom mieste. To sťažuje uskutočnenie správnych zmien v génoch, a teda účinnú liečbu dedičných chorôb. Vedci preto hľadajú spôsoby, ako zlepšiť výkonnosť systému. V roku 2016 bolo veľa vedeckých prác venovaných úprave CRISPR a jeho premene na rôzne génové nástroje.
Proteín Cas9 a crRNA - hlavné komponenty systému CRISPR
Obrázok: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
8. decembra teda časopis Cell publikoval článok vedcov z Torontskej univerzity, ktorí vytvorili „anti-CRISPR“- systém, ktorý za určitých podmienok mechanizmus vypína. To vám umožní potlačiť aktivitu Cas9, ak sa sprievodná RNA naviaže na nesprávny fragment a zabráni chybám. Anti-CRISPR sa skladá z troch proteínov inhibujúcich nukleázu. Prirodzene, spočiatku to nevynašli vedci, ale vírusy, ktoré tak neutralizovali imunitu baktérií.
V júni americkí vedci spolu s kolegami z Ruska potvrdili, že systém CRISPR / C2c2, získaný z fusobaktérie Leptotrichia shahii, je schopný štiepiť jednovláknovú RNA. Vďaka tomu je možné systém CRISPR použiť na vyradenie - potlačenie funkcií - mediátorovej RNA, ktorá prenáša informácie z génov do ribozómov, kde sa na jej základe syntetizujú proteíny.
V máji vytvorili vedci z Kalifornskej univerzity CRISPR-EZ, technológiu, ktorá umožňuje vkladanie nových molekúl DNA do genómov myších embryí s takmer stopercentnou úspešnosťou. Systém CRISPR / Cas9 sa vstrekuje do oplodnených zvieracích vajíčok pomocou mikroskopickej ihly a malého elektrického výboja. Vedcom sa vo svojom experimente podarilo zaviesť mutáciu v géne u 88 percent myší. To presahuje počet geneticky modifikovaných myší produkovaných úpravou CRISPR, ktorá používa konvenčné injekcie.
V apríli vyvinuli molekulárni biológovia z lekárskej fakulty University of Massachusetts s využitím mutantného variantu Cas9, ktorý nemá aktivitu nukleáz, technológiu CRISPRainbow. Sprievodná RNA, ktorá naznačuje, kde sa enzýmy pripájajú, obsahovala fluorescenčné značky, čo umožňuje napríklad sledovať pohyb mobilných genetických prvkov.
Komár Anopheles môže byť prvou obeťou systémov CRISPR
Foto: Jim Gathany / Wikipedia
Odvazny novy svet
Vedci už používajú systémy CRISPR na vytváranie geneticky modifikovaných organizmov, ako sú napríklad malárie, komáre, ktoré šíria škodlivé gény medzi svojimi divými príbuznými. Táto metóda sa nazýva génový pohon. Ak bol jeden z rodičov jednotlivca nosičom mutantného génu, potom ho s 50-percentnou pravdepodobnosťou prenesie na svojho potomka. Je to tak preto, lebo rodič má dve kópie génu a iba jedna z nich je chybná. CRISPR je schopný kopírovať mutantný fragment a vložiť ho do zdravého génu. Vďaka tomu dostanú potomkovia mutáciu so 100% pravdepodobnosťou.
V roku 2016 odborníci z Poradného výboru pre rekombinantnú DNA (RAC) schválili žiadosť z Pensylvánskej univerzity o vykonanie testov na ľudskú genetickú modifikáciu pomocou technológie CRISPR / Cas9.
Predbehli ich však Číňania. V novembri časopis Nature uviedol, že čínski vedci po prvý raz predstavili bunky s génmi modifikovanými systémom CRISPR / Cas9. Vedci extrahovali imunitné bunky (T lymfocyty) z krvi pacienta s metastatickým karcinómom pľúc a potom pomocou technológie CRISPR vypli gén, ktorý kóduje proteín PD-1. Ukázalo sa, že posledná uvedená látka potláča imunitu podporou rastu nádoru. Vedci kultivované bunky kultivovali, zvyšovali ich počet a potom ich injektovali späť do ľudského tela. To, či si génová terapia s touto chorobou poradí.
Systémy CRISPR sa dajú použiť aj na boj proti HIV a ľudským dedičným chorobám. Na vývoj účinnej liečby je však potrebný ďalší výskum. Samozrejme, nehovoríme o mutantoch, ako vo vedecko-fantastických filmoch, ale vedci budú schopní rýchlo vytvárať geneticky modifikované organizmy, napríklad poľnohospodárske rastliny odolné voči parazitom. Uvidí sa, prečo vedci, ktorí objavili CRISPR a prišli na to, ako by sa dal použiť, ešte nedostali Nobelovu cenu.
Alexander Enikeev