Genetické inžinierstvo otvára ľudstvu príležitosti na vytváranie predtým neexistujúcich organizmov a na ničenie genetických chorôb. Veci však nie sú také ružové, pretože ani prelomová technológia CRISPR / Cas9 zďaleka nie je dokonalá. Chyby, ktoré robí, môžu byť zriedkavé, ale stačí jedna na to, aby sa človeku stala osudnou. Lenta.ru hovorí o tom, čo nie je v poriadku s CRISPR a ako sa vedci snažia situáciu napraviť.
Systém CRISPR / Cas9 - druh nožníc na DNA - sa oprávnene považuje za revolúciu v oblasti genetického inžinierstva. S jeho pomocou môžu vedci upravovať ľudský genóm, odstraňovať z neho škodlivé mutácie a liečiť tak nepríjemné a smrteľné dedičné choroby. Nemalo by si však myslieť, že také metódy predtým neexistovali. Vo výzbroji genetikov boli napríklad nukleázy obsahujúce zinkové „prsty“a endonukleázy - enzýmy, ktoré štiepia molekuly DNA na konkrétnych miestach. Pokiaľ ide o presnosť, všestrannosť a náklady, s CRISPR / Cas9 znateľne strácajú, hoci ten zďaleka nie je dokonalý.
CRISPR / Cas9 pôvodne nevytvorili vedci, ale príroda. Je to molekulárny mechanizmus, ktorý existuje vo vnútri baktérií a umožňuje im bojovať proti bakteriofágom a iným parazitom. V skutočnosti funguje ako imunita proti infekcii. CRISPR (skratka pre „krátke palindromické opakovania, pravidelne rozmiestnené v skupinách“) sú špeciálne oblasti (loci) DNA. Obsahujú krátke fragmenty DNA vírusov, ktoré kedysi infikovali predkov dnešných baktérií, ale boli porazení ich vnútornou obranou. Tieto kúsky sa nazývajú rozpery a sú navzájom oddelené opakujúcimi sa sekvenciami.
Keď bakteriofág napadne baktériu, každá opakujúca sa sekvencia a susedný spacer sa použijú ako templát pre syntézu molekúl nazývaných crRNA. Vytvorí sa veľa rôznych reťazcov RNA, ktoré sa viažu na proteín Cas9, ktorého úloha je mimoriadne jednoduchá: rozrezať DNA vírusu. Bude to však môcť urobiť až potom, čo crRNA nájde komplementárny fragment vírusovej DNA. Keď Cas9 rozpadne cudziu nukleovú kyselinu, táto je úplne zničená inými nukleázami.
CRISPR / Cas9 je dobrý práve pre svoju presnosť, pretože pre baktérie je správne fungovanie imunitného systému otázkou života a smrti. „Antivírusový“systém musí nájsť časť vírusovej DNA medzi miliónmi ďalších, a čo je najdôležitejšie, nezamieňať ju s vlastným genómom. Počas miliónov rokov evolúcie tento mechanizmus zdokonalili baktérie. Hneď potom, ako prišli na to, prečo je potrebný systém CRISPR, si uvedomili, že sa dá skrotiť ako bezprecedentne presný nástroj na úpravu génov.
Na nahradenie jednej špecifickej oblasti v genóme inou je potrebné syntetizovať sprievodnú RNA, ktorá je v princípe podobná crRNA. Hovorí Cas9, kde je potrebné urobiť dvojvláknový zlom v DNA modifikovaného organizmu. Gén však nemusíme kaziť, ale upravovať - napríklad nahradiť jeden alebo viac nukleotidov a odstrániť škodlivú mutáciu. Tu opäť prichádza na pomoc príroda. Prirodzené opravné mechanizmy okamžite začnú obnovovať rezanú reťaz. Trik spočíva v tom, že za týmto účelom sa niektoré fragmenty RNA odstránia v blízkosti zlomu, načo sa tam vložia podobné sekvencie. Vedci ich môžu nahradiť vlastnými sekvenciami DNA a modifikovať tak genóm.
Schematické znázornenie systému CRISPR
Propagačné video:
Obrázok: Kaidor / Wikipedia
Nič však nie je dokonalé. Napriek relatívnej presnosti systémy CRISPR niekedy robia chyby. Jeden z dôvodov spočíva v samotnej povahe systému. Pre baktérie je nevýhodné, aby sa crRNA zhodovala o 100 percent s fragmentom vírusovej DNA, ktorý sa môže líšiť o jeden alebo dva nukleotidy. Je pre ňu lepšie, že niektoré nukleotidy sa môžu líšiť, čo dáva mikroorganizmom väčšie šance v boji proti infekcii. V genetickom inžinierstve zároveň nízka špecificita hrozí chybami: zmeny je možné robiť na nesprávnom mieste. Ak sa to stane počas experimentov na myšiach, potom nejde o nijakú zvláštnu tragédiu, ale úprava ľudského genómu by sa mohla zmeniť na katastrofu.
To vysvetľuje obavy západných vedcov z experimentov, ktoré sa uskutočňujú v Číne. Ázijskí vedci použili technológiu CRISPR na genetickú modifikáciu ľudských embryí. Takéto experimenty boli zakázané v Európe a Spojených štátoch, ale nedávno ich povolilo Spojené kráľovstvo - iba na výskumné účely. Takéto embryá budú musieť byť zničené za pár týždňov po ich prijatí, čo vylučuje „množenie“GM ľudí.
CRISPR / Cas9 by však nebol taký skvelý, keby sa nedal vylepšiť. Vedci teda naučili Cas9 prerušiť nie dva reťazce naraz, ale iba jeden. Rez je uskutočnený na dvoch rôznych miestach v sekvencii DNA na rôznych vláknach, takže systém musí byť schopný rozpoznať dvakrát toľko nukleotidov ako je bežné, čo ho robí presnejším.
Proteín Cas a crRNA
Foto: Thomas Splettstoesser / Wikipedia
Vedci z University of Western Ontario našli ďalší spôsob, ako túto technológiu vylepšiť. Pokúsili sa vyriešiť problém s opravou rozrezanej DNA. Rýchla obnova reťazca nukleovej kyseliny vedie k tomu, že vedci nemajú čas na vlastné opravy genómu. Tak sa vytvára začarovaný kruh: reťaz, ktorá je nežiaducim spôsobom opravená, musí byť znovu rozrezaná proteínom Cas9.
Aby sa tomu zabránilo, vedci upravili proteínové nožnice tak, aby vytvorili proteín TevCas9. Rozrezáva reťazec DNA na dvoch miestach, čo sťažuje opravu miesta. Na syntézu nového enzýmu sa do Cas 9 pridal enzým I-Tevl, ktorý je tiež endonukleázou, teda proteínom, ktorý štiepi molekulu DNA v strede, a nie štiepiť konce sekvencie, ako to robia exonukleázy. Ukázalo sa, že výsledný fúzny proteín je presnejší pri väzbe na konkrétne miesta a je menej pravdepodobné, že urobí chybu a chybné miesto rozreže.
Kryštalická štruktúra Cas9 viazaná na DNA
Foto: projekt wiki Cas9 / Wikipedia
Existuje ďalší spôsob, ako zvýšiť presnosť systémov CRISPR. „Preteky v zbrojení“medzi baktériami a vírusmi viedli nielen k rozvoju obranných systémov v mikroorganizmoch, ale aj k spôsobom ich neutralizácie. Bakteriofágy teda rýchlo mutujú a strácajú oblasti, podľa ktorých ich bakteriálna imunita rozpoznáva. Niektoré kódy však obsahujú proteíny anti-CRISPR, ktoré interferujú s prácou komplexu crRNA-Cas9.
8. decembra uverejnil časopis Cell článok vedcov z Torontskej univerzity, ktorí vytvorili „anti-CRISPR“- systém, ktorý umožňuje za určitých podmienok mechanizmus vypnúť. Zabraňuje nežiaducim chybám potlačením aktivity Cas9 v prípade, že sa vodiaca RNA naviaže na nesprávny fragment. Anti-CRISPR sa skladá z troch proteínov, ktoré inhibujú nukleázu a sú kódované génmi jedného z bakteriálnych vírusov.
Technológia CRISPR sa už používa na liečbu závažných chorôb, ako je leukémia a rakovina pľúc, a tiež sa testuje na odstránenie HIV z imunitných buniek. Keď vedci nájdu nové spôsoby, ako túto metódu vylepšiť, otvorí sa čoraz viac príležitostí na jej použitie.
Alexander Enikeev