Vynález editora génov CRISPR-Cas sa nazýva revolúcia v biológii. Vedci sľubujú, že ho využijú na zlepšenie odrôd rastlín a plemien zvierat pre poľnohospodárstvo, na liečbu vrodených genetických chorôb u ľudí. Korešpondent RIA Novosti sa rozhodol, kto a ako sa upravuje genóm.
Centrum úpravy genómu Moskovskej štátnej univerzity sa otvorilo pred vyše rokom - v areáli univerzity. Stretol som sa s jeho riaditeľom, doktorom chémie, Peterom Sergievom, a keď ideme vo výťahu, trochu sa venuje histórii genetického inžinierstva.
„Genom bol už upravený. Na tento účel však bolo ťažké vytvoriť nástroje, trvalo to dlho a výsledok často nebol tak, ako sme to chceli, “hovorí.
Vo viváriu sa Pyotr Vladimirovich mení na modré laboratórne oblečenie, dá mi jednorázové biele kombinézy a požiada ma, aby som si utrel kameru alkoholom. Teraz vyzerá Petr Vladimirovič ako chirurg a ja - ako laboratórny asistent zo série „CSI - Scene Crime“.
V sterilnom laboratóriu pre nás bola pripravená nádoba s oplodnenými myšacími vajíčkami a skúmavka s roztokom RNA. To je všetko, čo potrebujete na úpravu genómu CRISPR-Cas.
CRISPR je anglická skratka pre frázu, ktorá doslova znamená „pravidelne zoskupené krátke palindromické opakovania“. V skutočnosti ide iba o malé úseky DNA bakteriofágových vírusov zabudovaných do bakteriálneho genómu. Tieto sekvencie sú potrebné pre fungovanie bakteriálneho imunitného systému a slúžia ako druh oznámenia „polície“. Ak baktéria prežije po infikovaní bakteriofágom, použije proteínové enzýmy Cas na odrezanie časti svojej DNA a jej vloženie do svojho genómu, aby sa neskôr rozpoznala. Bakteriálny genóm dedí túto knižnicu „nepriateľov“starostlivo zozbieranú predchádzajúcimi generáciami.
V roku 2013 vedci zistili, že proteín Cas funguje v akomkoľvek organizme vrátane cicavcov. Je schopný urobiť smerové zlomy v oboch reťazcoch molekuly DNA, a tak zmeniť genóm.
Propagačné video:
Manipulácia s vajíčkami
Petr Sergiev vyrába sklenenú kapiláru s priemerom sto mikrónov v mikrovraku, vtiahne do neho vajíčko a prenesie ho pod sklo živným médiom. Hotová vzorka sa odošle do štádia optického mikroskopu. Monitor zobrazuje zväčšený obraz vajíčka, chvejúce sa na špičke kapiláry. Vynikajú dve zaoblené škvrny - jedná sa o pronuclei s DNA matky a otca.
Vedec pripravuje ďalšiu kapiláru s rádovo menším priemerom. Toto je injekčná striekačka. Zhromažďuje do nej roztok s dvoma druhmi RNA a pomocou manipulátorov jemne prepichne vajíčko. To je všetko, injekcia je hotová.
RNA vstreknutá do vajíčka je potrebná na odrezanie genómu v danom mieste. Jeden typ RNA obsahuje presne definovanú sekvenciu nukleotidov, podobnú tej, ktorú sme chceli zmeniť. Úlohou tejto RNA je nájsť zodpovedajúcu oblasť v DNA, preto sa nazýva „sprievodca“. RNA druhého typu, matrica, je druhom inštrukcie na syntézu nukleázového proteínu Cas9. Tento proteín pôsobí ako katalyzátor pre chemickú reakciu, ktorá prerušuje fosfodiesterové väzby medzi dobre definovanými bázami DNA. Pretože proteínová molekula má dve nukleázové centrá, sú obidva vlákna DNA otvorené, navyše na mieste, ktorých súradnice Cas9 "počítajú" s vodiacou RNA.
Molekula DNA vníma zlom v obidvoch reťazcoch ako vážne poškodenie a snaží sa ho opraviť. Exonukleázové enzýmy vznášajúce sa v bunke okamžite odstránia niekoľko nukleotidov z obidvoch koncov zlomu. To je dosť na to, aby sme zlomili alebo, ako hovoria genetici, „vypnite“gén.
Ako funguje genomický editor CRISPR-Cas9 / Ilustrácia RIA Novosti. Alina Polyanina.
Ak je napríklad potrebná cielená mutácia, je potrebné označiť proteín, aby sa mohol sledovať v tele, potom sa do komplexu pridá k dvom RNA iná templát vo forme špeciálne navrhnutej DNA. Pozostáva zo sekvencií identických s okrajmi budúceho zlomu a obsahuje aj časť, ktorá sa má vložiť. Keď Cas9 odreže molekulu DNA, jej konce sa spoja pomocou tejto ďalšej šablóny, takže sada nukleotidov, ktorú potrebujeme, sa vloží do zlomku.
„K veveričke môžeme pripevniť malý chvost, pomocou ktorého je vhodné ju vytiahnuť a zistiť, s čím interaguje. Môžeme vložiť gén, ale nie je taký účinný ako jeho vypnutie, “vysvetľuje vedec.
GMO a chiméry
Upravené vajíčko sa transplantuje do maternicovej skúmavky náhradnej myši. Žila nejaký čas s mužom, ktorého semenné kanáliky boli zviazané. Pár mal normálny sexuálny život, ale nedokázal počať. Avšak telo myši verilo, že je tehotná a vytvorila pre ňu vhodné hormonálne pozadie. Teraz táto žena nesie plod niekoho iného.
O tri týždne porodí najbežnejšie myši. Vedci budú čakať, až dorastú hlodavce, odobrať z nich malý kúsok chvosta a pomocou PCR analyzovať časť DNA, ktorú upravili. Mutácia alebo zakázaný gén sa nachádzajú vo viac ako polovici prípadov. Reverzný postup - vloženie sekvencie do genómu - neuspeje pri viac ako 10% pokusov.
Pri úprave sa objavujú rôzne zaujímavé efekty. Narodia sa napríklad mozaikové myši alebo chiméry, ktoré majú bunky s rôznymi variáciami materských a otcovských genómov. Cas9 môže rezať DNA mnohokrát, ale messengerová RNA, ktorá ho kóduje, nie je večná a injikovaný roztok jednoducho zmizne v sérii bunkových delení. Editor niekedy niekedy vystrelí aj potom, čo sa pronuklei spojili a vajíčko sa rozdelilo. A keďže oprava DNA po prasknutí je vždy náhodný proces a liečenie sa nikdy nestane rovnakým spôsobom, niektoré bunky v jednom organizme budú obsahovať ďalšiu mutáciu.
Pre vedu a medicínu
Pohybujeme sa v susednej miestnosti a sledujeme živé výsledky experimentov na úpravu genómu. Na poliach vľavo - nádoby s geneticky modifikovanými myšami, vpravo - so spoločnými hlodavcami na kontrolu. Pestovali sa rovnako ako vľavo, ale genóm nebol zmanipulovaný. Kontrolné myši sú potrebné, aby mali pred našimi očami normu a porovnávali s nimi zvieratá získané v experimente.
Pyotr Sergiev vezme jeden z nádob s párom sivých myší. Navonok sú úplne bežné, ale nemajú potomka. Faktom je, že u samcov je gén jednej z RNA metyltransferáz, enzým produkovaný iba v spermii, vypnutý. Samce s inaktívnym génom sa rodia sterilne. Presný účel génu a enzýmu je stále neznámy. Aby sa zistilo, boli v laboratóriu chované dva kmene myší: jeden mal vypnutý gén, druhý mal proteín značený pomocou genomického editora.
„Mutácia v tomto géne sa vyskytuje aj u ľudí - potom človek trpí neplodnosťou. Ale kým nezistíme, prečo je to potrebné, prečo modifikuje RNA, nebudeme schopní takýmto pacientom pomôcť, “vysvetľuje vedec.
V skutočnosti stále nepoznáme funkciu väčšiny ľudských génov. Zistenie tohto je základnou úlohou, ktorú rieši mnoho výskumných skupín po celom svete vrátane Ruska. Myší genóm je veľmi podobný genómu ľudí. Dúfame, že s pomocou systému CRISPR-Cas sa štúdium genómu každého stvorenia zrychli.
Sergievova skupina spolu s N. N. NN Petrova sa pustila do hľadania mutácií vedúcich k niektorým typom rakoviny. Medzi najbližšie plány patrí projekt na vytvorenie geneticky modifikovaných zvierat pre poľnohospodárstvo v spolupráci s All-ruským výskumným ústavom živočíšnej výroby a Ústavom génovej biológie Ruskej akadémie vied.
„CRISPR-Cas je fantastický nástroj, ktorý vám umožňuje zmeniť genóm podľa vášho uváženia a stať sa tak trochu Bohom. Úlohou vedy je v konečnom dôsledku pochopiť, ako funguje také zložité stvorenie, ako je cicavec, “hovorí vedec.
Riešenie základných vedeckých problémov je skvelé, ale čo táto technológia dá medicíne? V dohľadnej budúcnosti nie je toho veľa. Je ľahké upraviť vajíčko a zvýšiť geneticky modifikovanú myš, ale nie je možné opraviť gény dospelého zvieraťa, natož človeka.
Metódy úpravy DNA v somatických (to znamená už vytvorených bunkách) sú stále veľmi neúčinné. Ak chcete do bunky zaviesť gén vypnutý mutáciou a prinútiť ho, aby produkoval určitý proteín, musíte z tela odstrániť niektoré bunky, upraviť v nich DNA a vložiť ju späť do tela. V zásade existuje nádej, že týmto spôsobom bude možné bojovať proti chorobám, ako je Duchennova svalová dystrofia alebo cystická fibróza, keď je potrebné obnoviť účinnosť niektorých častí buniek. Pokiaľ ide o náchylnosť na rakovinu, genomický editor je doteraz bezmocný. Ak sa mutantný gén nachádza u človeka, nachádza sa vo všetkých bunkách tela. Je nereálne meniť ich všetky. A každá bunka s mutáciou je zdrojom nebezpečenstva.
Aj keď CRISPR / Cas pomôže odpovedať iba na niektoré základné otázky a umožní liečbu zriedkavých genetických chorôb, bude to pre ľudstvo stále veľký krok vpred.
Tatiana Pichugina