Medzinárodný tím vedcov z USA, Francúzska a Číny vytvoril polosyntetickú formu života. Aj keď už boli uskutočnené pokusy o získanie baktérií s modifikovanou DNA, mikroorganizmy sa množili zle, vyžadovali si špeciálne podmienky rastu a nakoniec sa zbavili modifikácií, ktoré do nich boli zavedené. „Lenta.ru“hovorí o novom diele, v ktorom sa vedcom podarilo vyriešiť tieto problémy, keď získali tvora, ktorý sa radikálne líši od všetkého prírodného života na Zemi.
Nie je to tak dávno, čo DNA všetkých živých organizmov na našej planéte pozostávala zo štyroch typov nukleotidov obsahujúcich adenín (A) alebo tymín (T) alebo guanín (G) alebo cytozín ©. Struny desiatok alebo stoviek miliónov nukleotidov tvoria samostatné chromozómy. Gény nachádzajúce sa na chromozómoch sú v podstate dlhé nukleotidové sekvencie, v ktorých sú kódované aminokyselinové sekvencie proteínov. Kombinácia troch po sebe nasledujúcich nukleotidov (kodón alebo triplet) zodpovedá jednej z 20 aminokyselín. Život teda používa trojpísmenový genetický kód (ATG, CGC atď.) Založený na štvorpísmenovej abecede (A, C, T, G).
Keď bunka organizmu potrebuje proteín (polypeptid), zapne sa gén, ktorý ju kóduje. Posledne menovaný je pripojený k špeciálnemu enzýmu nazývanému RNA polymeráza, ktorý počas procesu transkripcie začne sledovať sled nukleotidov a vytvárať jeho kópiu vo forme molekuly nazývanej messenger RNA (mRNA). RNA je veľmi podobná DNA, ale namiesto tymínu obsahuje uracil (U). Potom mRNA opustí bunkové jadro a ide do ribozómov, kde slúži ako recept na vytvorenie aminokyselinového reťazca proteínu počas translácie.
Vedci sa rozhodli zmeniť genetický kód Escherichia coli pridaním ďalších dvoch „písmen“. Faktom je, že DNA v živých organizmoch je dvojnásobná, to znamená, že je tvorená dvoma reťazcami, ktoré sú navzájom párované komplementárnymi väzbami. Takéto väzby sa tvoria medzi bázou A-nukleotidu z jedného vlákna a bázou T-nukleotidu z druhého vlákna (podobne medzi C a G). Preto musia byť dva nové syntetické nukleotidy schopné komplementárne sa párovať. Voľba padla na dNaM a d5SICS.
E. coli Escherichia coli
Foto: Rocky Mountain Laboratories / NIAID / NIH
Jeden pár syntetických nukleotidov bol vložený do plazmidu - dvojvláknovej kruhovej molekuly DNA, ktorá je schopná množiť sa oddelene od zvyšku bakteriálneho genómu. Nahradili pár komplementárnych nukleotidov A a T, ktoré boli súčasťou laktózového operónu - súbor génov, ktoré metabolizujú laktózový cukor, a s nimi spojené nekódujúce sekvencie DNA. Syntetické nukleotidy neboli zahrnuté do oblasti, ktorú polymeráza kopíruje v mRNA.
Propagačné video:
Prečo sa vedci rozhodli nevložiť syntetické nukleotidy priamo do génu, ale vedľa neho? Faktom je, že je veľmi ťažké zmeniť gén týmto spôsobom, aby zostal funkčný. Nakoniec, na to musíte viazať výsledné nové kodóny na akékoľvek aminokyseliny. Z tohto dôvodu je zase nevyhnutné naučiť bunku produkovať rôzne typy transportnej RNA (tRNA), ktorá dokáže tieto kodóny rozpoznať.
Molekuly tRNA vykonávajú nasledujúcu funkciu. Rovnako ako nákladné vozidlá nesú na jednom konci určitú aminokyselinu, približujú sa k mRNA v ribozómoch a naopak začínajú porovnávať triplet nukleotidov na druhom konci s kodónom. Ak sa zhodujú, aminokyselina sa odstráni a zabuduje do proteínu. Ak však neexistuje vhodná tRNA, proteín nebude syntetizovaný, čo môže negatívne ovplyvniť životaschopnosť buniek. Vedci by preto museli vložením syntetických nukleotidov do génov vytvoriť gény, ktoré kódujú nové tRNA, ktoré dokážu rozpoznať umelé kodóny a pripojiť správnu aminokyselinu k polypeptidu. Úloha vedcov však bola jednoduchšia. Potrebovali zabezpečiť, aby sa plazmid so syntetickými nukleotidmi úspešne množil a prenášal do dcérskych organizmov.
Plazmidy použité na transformáciu Escherichia coli
Obrázok: Denis A. Malyshev / Kirandeep Dhami / Thomas Lavergne / Tingjian Chen / Nan Dai / Jeremy M. Foster / Ivan R. Correa / Floyd E. Romesberg / Príroda / Katedra chémie / Výskumný ústav Scripps
Tento plazmid, označený ako pINF, bol zavedený do E. coli. Na jeho kopírovanie je však potrebné, aby sa vo vnútri bakteriálnej bunky nachádzalo veľa nukleotidov. Na tento účel bol do E. coli vložený ďalší plazmid, pCDF-1b. Obsahoval gén pre rozsievku Phaeodactylum tricornutum PtNTT2, ktorý kóduje proteín NTT, ktorý transportuje nukleotidy z živného média do bunky.
Vedci však čelili mnohým ťažkostiam. Po prvé, proteíny Phaeodactylum tricornutum majú toxický účinok na bunku E. coli. Všetko kvôli prítomnosti fragmentu aminokyselinovej sekvencie, ktorá nesie signálnu funkciu, v nich. Vďaka nej má proteín v bunke rias správnu pozíciu, po ktorej je sekvencia odstránená. E. coli nedokáže tento fragment odstrániť, preto jej vedci pomohli. Podarilo sa im odstrániť prvých 65 aminokyselín z NTT. To významne znížilo toxicitu, aj keď tiež znížilo rýchlosť transportu nukleotidov.
Ďalším problémom bolo, že syntetické nukleotidy boli dlho zadržiavané v plazmidoch a neboli nahradené pri kopírovaní DNA. Ako sa ukázalo, ich bezpečnosť závisela od toho, aké nukleotidy ich obklopili. Vedci analyzovali rôzne kombinácie vložené do 16 plazmidov. Aby pochopili, či syntetický nukleotid vypadol zo sekvencie, použili vedci technológiu CRISPR / Cas9.
CRISPR / Cas9
Obrázok: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
CRISPR / Cas9 je molekulárny mechanizmus, ktorý existuje vo vnútri baktérií a umožňuje im bojovať proti bakteriofágom. Inými slovami, táto technológia predstavuje imunitu proti vírusovým infekciám. CRISPR je špeciálny kúsok DNA. Obsahujú krátke fragmenty DNA vírusov, ktoré kedysi infikovali predkov dnešných baktérií, ale boli porazení ich vnútornou obranou.
Keď bakteriofág vstúpi do baktérií, tieto fragmenty sa používajú ako templát pre syntézu molekúl nazývaných crRNA. Vytvorí sa veľa rôznych reťazcov RNA, ktoré sa viažu na proteín Cas9, ktorého úlohou je rezať DNA vírusu. Môže to urobiť až potom, čo crRNA nájde komplementárny fragment vírusovej DNA.
Ak sa namiesto crRNA použije sekvencia RNA komplementárna s určitým fragmentom plazmidu, potom plazmid rozštiepi aj Cas9. Ale ak sú v tomto fragmente syntetické nukleotidy, potom proteín nebude fungovať. Použitím CRISPR je teda možné izolovať tie plazmidy, ktoré sú rezistentné na nežiaduce mutácie. Ukázalo sa, že v 13 zo 16 plazmidov bola strata syntetických nukleotidov zanedbateľná.
Vedcom sa teda podarilo vytvoriť organizmus so zásadnými zmenami v DNA, ktorý je schopný zadržať ich v sebe donekonečna.
Aj keď polosyntetická forma života má vo svojom genóme iba dva neprirodzené nukleotidy, ktoré sa nenachádzajú v kodónoch a nezúčastňujú sa na kódovaní aminokyselín, je to prvý rezistentný organizmus, ktorého abeceda DNA pozostáva zo šiestich písmen. V budúcnosti budú vedci s najväčšou pravdepodobnosťou schopní použiť túto inováciu na syntézu proteínov, čím sa vytvorí plnohodnotný umelý genetický kód.
Alexander Enikeev