Spoločnosť EGenesis, ktorá sa špecializuje na produkciu geneticky modifikovaných ošípaných určených na transplantáciu ľudských orgánov, oznámila narodenie viacerých upravených zvierat. Stratili tri gény, získali deväť a tiež stratili 25 vírusov množiacich sa v genóme. Ošípané sú zároveň úplne zdravé a plodné a ich bunky nespôsobujú agresivitu v zložkách ľudského imunitného systému. V nadchádzajúcich rokoch sa plánujú klinické pokusy s transplantáciami u ľudí. Predtlač práce je zverejnená na portáli bioRxiv.
Pri transplantácii ľudských orgánov existujú tri prekážky. Prvým je fyziologická znášanlivosť: orgán musí byť vhodný z hľadiska veľkosti, štruktúry a funkcie. V tomto zmysle je vhodným objektom ošípané, z ktorých mnohé orgány - napríklad srdce alebo obličky - sa významne nelíšia od ľudských orgánov.
Druhou prekážkou je odmietnutie imunity. Ľudské telo reaguje opatrne na akékoľvek neznáme molekuly, ale niektoré - napríklad cukry na povrchu cudzích buniek - spôsobujú obzvlášť silnú agresiu.
Nakoniec, tretí je vírus, ktorý každý organizmus nesie vo svojom genóme. Nehovoríme o aktívnych vírusoch, ktoré spôsobujú epidémie, ale o endogénnych, to znamená o vírusoch, ktoré nezabíjajú bunku, ale množia sa iba v jej jadre. Ak však bunka stále nejako udržuje svoje vírusy pod kontrolou, potom, ak ju cudzie bunky infikujú novými vírusmi, nemusí sa vyrovnať s dôsledkami ich reprodukcie.
Aby sa orgán ošípaných stal kompatibilným s ľuďmi, berúc do úvahy všetky tieto požiadavky, je potrebné súčasne vykonať zmeny vo viacerých génoch. Najprv sa to snažili dosiahnuť pomocou génových knockoutov a srdce ošípaných s niekoľkými knockoutmi trvalo v tele paviána celé tri roky.
V roku 2015 však americký genetik George Church a čínsky biológ Luhan Yang založili spoločnosť eGenesis, spoločnosť, ktorej cieľom bolo vytvárať ošípané modifikované viacerými génmi naraz. Po chvíli vedci pod vedením Cirkvi uviedli, že boli schopní úplne očistiť bunky ošípaných od endogénnych retrovírusov. Teraz Church a Jan urobili ďalší krok: vytvoriť zvieratá „bez vírusov“a imunologicky kompatibilné zvieratá.
Aby to bolo možné dosiahnuť, vedci z eGenesis museli vyvinúť viacstupňový protokol. Na začiatok odobrali kultúru fibroblastov z ucha obyčajného prasaťa. Pomocou elektroporácie sa do nich zaviedli molekuly systému CRISPR / Cas9, aby vystrihli tri gény z DNA, ktoré spôsobujú najsilnejšie odmietnutie v ľudskom tele. Súčasne bol do buniek zavedený plazmid s deviatimi novými, už ľudskými génmi, ktoré sú zodpovedné za potlačenie procesov imunitnej reakcie a zrážania krvi. Výsledné bunky by teda nemali spôsobiť nielen imunitnú agresiu, ale tiež ju potlačiť.
Po potvrdení, že editácia bola úspešná, vedci odstránili jadrá fibroblastov a umiestnili ich do vajíčok neobsahujúcich jadrové bunky, čo je dávno zavedená metóda klonovania. Embryá sa vyvinuli z vajíčok, ktoré boli vysadené náhradnými matkami, ktoré porodili prasiatka prvej generácie. Tieto ošípané stále nosili vírusy, ale ukázalo sa, že už boli imunologicky kompatibilné s ľuďmi.
Propagačné video:
Vedci opäť izolovali kultúru fibroblastov z tela a vykonali v nej ďalšiu fázu úpravy: opäť pomocou elektroporácie bol do buniek zavedený systém CRISPR / Cas9, ktorý napadol gén reverznej transkriptázy, kľúčový enzým, s ktorým sa endogénne vírusy množia v genóme. Potom boli izolované bunkové jadrá, umiestnené do oocytov a boli získané prasiatka druhej generácie. Ošípané tak stratili tri gény, získali deväť a tiež stratili dvadsaťpäť aktívne množiacich sa vírusov.
Vedci overili, že upravené ošípané boli geneticky stabilné. V ich bunkách sa skutočne exprimovalo osem z deviatich ľudských génov a gény, ktoré spôsobujú odmietnutie imunity, boli „tiché“. Vedci skontrolovali zvierací genóm kvôli stopám mimo cieľovej úpravy a našli niekoľko „chýbajúcich“CRISPR / Cas9, ale neovplyvnili DNA oblasti kódujúce proteín.
Samotné zvieratá boli fyziologicky zdravé a plodné. Napriek narušeniu imunity a zrážanlivosti krvi bol ich krvný obraz v rámci normálnych limitov. Vedci tiež nenašli žiadny vplyv úprav na prácu srdca, pečene a obličiek ošípaných.
Nakoniec vedci testovali, či geneticky upravené ošípané získali vlastnosti potrebné na transplantáciu. Najskôr izolovali bunkovú kultúru z cievnych stien ošípaných a ošetrili ju ľudskými imunoglobulínmi: viažu sa na modifikované bunky o 90 percent menej ako bunky normálne. Potom tieto bunky pôsobili na ľudské komplementové proteíny - reagujú na prítomnosť cudzích buniek ešte skôr ako na imunoglobulíny - ale komplementový systém sa aktivoval nie častejšie ako v prípade ich vlastných ľudských buniek.
Vedci tak dokázali vytvoriť zvieratá, ktorých bunky nespôsobujú okamžitú agresiu ľudskej imunity. Napriek tomu, že imunitný systém môže neskôr reagovať na cudzie bunky a rozpoznávať na nich zriedkavejšie proteíny, je to možné vyriešiť pomocou imunosupresív. Úpravy na druhej strane vám umožňujú vyhnúť sa akútnemu odmietnutiu a získať čas na to, aby sa orgán zakorenil vnútri tela. V rozhovore pre vedu spoločnosť Yang objasnila, že spoločnosť sa plánuje v roku 2020 zamerať na predklinické testovanie, ale v nasledujúcich piatich rokoch očakáva prechod k ľudskému výskumu.
Autor: Polina Loseva
