Fantastický strach z mnohých príbehov o zasahovaní do ľudského genómu po mnoho rokov zostal len fantastický. Teraz však existuje taká metóda: systém CRISPR / Cas9 požičaný od baktérií umožňuje uskutočňovať genetickú modifikáciu všetkých organizmov s veľmi vysokou presnosťou.
imunita
- prirodzená „imunita“baktérií, biochemický systém obrany proti vírusom, ktorý vyžadujú jednobunkové organizmy, ktoré nie sú schopné udržať komplexný imunitný systém, ako je ten náš. Prvé náznaky jeho existencie sa našli na konci osemdesiatych rokov, keď Yoshizumi Ishino a jeho kolegovia skúmali spoločný Escherichia coli, presnejšie jeden z jeho nepodstatných génov (iap).
Len pre prípad, že Japonci sekvencovali svoju sekvenciu spolu s regiónmi na svojich stranách: možno budú niektoré fragmenty zapojené do regulácie aktivity iap? Namiesto toho sa biológovia nachádzajú v DNA dlhých sekvenciách opakovania, úplne identické opakovania presne 29 nukleotidov dlhé. Medzi nimi - ako suché rastliny medzi listami papiera v herbári - sa položili krátke fragmenty s dĺžkou 32 nukleotidov, ktoré sa nijakým spôsobom neopakovali.
Štruktúra nukleotidov.
Neskôr sa tento zvláštny kúsok DNA nazval „pravidelne zoskupené, oddelené krátke palindromické opakovania“- pravidelne zoskupené krátke palindromické opakovania. Inak sa práca na nich zastavila na dlhú dobu, hoci mnohí vedci sa zaujímali o záhadné oblasti chromozómu a niektorí dokonca hovorili o ich úlohe. Funkčný význam CRISPR zostal záhadou a nikto od nich neočakával žiadne zvláštne objavy: „Biologický význam týchto sekvencií nie je jasný,“v tom čase Isino a kol.
V druhej polovici 90. rokov sa však začal skutočný rozmach sekvenovania. Bolo ľahšie vytvoriť sekvenciu DNA a genómy stále viac organizmov začali dopĺňať počítačové databázy a boli analyzované zo všetkých strán. Záhadná - a zdanlivo nezmyselná, úplne na rozdiel od akéhokoľvek génu - sekvencia CRISPR sa našla všade v baktériách. Holandský biológ Ruud Jansen si všimol, že vždy existujú súčasne s génmi rovnakých proteínov. Ich funkcie boli potom tiež neznáme a jednoducho sa nazývali „proteíny spojené s CRISPR“(proteíny spojené s CRISPR, Cas).
Zjednodušená schéma štruktúry CRISPR.
Propagačné video:
A až v roku 2005 tri skupiny vedcov naraz uviedli, že jedinečné oblasti CRISPR sú fragmenty vírusových genómov. "Potom za mnou niečo kliklo," - neskôr si pripomenul svetoznámeho bioinformátora a evolucionistu Evgenyho Kunina. V tom čase už niekoľko rokov zápasil o hádanku CRISPR - a nakoniec na neho dopadlo: táto DNA by mohla byť súčasťou antivírusovej obrany bakteriálnej bunky.
Táto myšlienka oslovila mikrobiológa Rodolphe Barrang, ktorý v tom čase pracoval pre spoločnosť jogurtov spoločnosti Danisco. V tomto odbore môže vírusová epidémia spôsobená baktériami mliečneho kvasenia spôsobiť vážne straty a výskumník hľadal spôsoby, ako ich chrániť. Na testovanie Kuninovej hypotézy infikoval Streptococcus thermophilus dvoma kmeňmi bakteriofágov. Väčšina baktérií uhynula, ale tí, ktorí prežili, boli voči týmto vírusom celkom rezistentní. Vedci sekvenovaním svojej DNA potvrdili, že sa v nej objavili stopy stretnutia.
náradie
Jennifer Doudna a Blake Wiedenheft začali študovať štruktúru proteínov Cas: do tejto doby sa ukázalo, že pôsobia ako nukleázy, to znamená rezaná DNA. Napriek všetkým zisteniam bol význam objavu stále nejasný: „Nemáte konkrétny praktický účel,“vysvetlila Dudna Wiedenheftovi, ktorý pracoval v jej laboratóriu. „Je len dôležité pochopiť, ako to funguje.“Postupom práce sa však vyjasnilo mnoho úžasných detailov.
CRISPR je skutočne niečo ako herbár, katalóg, v ktorom bakteriálna bunka uchováva vzorky, fragmenty genómov vírusov, s ktorými sa musela stretnúť so svojimi predkami. Tento katalóg môžu používať špeciálne proteíny spojené s CRISPR (CRISPR-Associated Proteins, Cas). Na základe týchto vzorov rýchlo rozoznávajú nové vírusové gény a rozrezávajú ich, čo ich zbavuje schopnosti.
Biológ Karl Zimmer vysvetľuje systém CRISPR / Cas nasledovne: „Keď sa oblasť CRISPR zaplní vírusovou DNA, stáva sa kľúčovou galériou v bunke a zobrazuje portréty mikróbov, s ktorými sa baktérie stretli. Následne môže byť táto vírusová DNA použitá na "zacielenie" na presnú zbraň proteínov Cas."
Za týmto účelom bakteriálna bunka syntetizuje krátke vzorky RNA molekúl na uložených fragmentoch DNA. Každý z týchto RNA sprievodcov (gRNA) sa viaže na proteín Cas, ktorý môže rezať DNA zodpovedajúcu vzorke. Tieto komplexy neustále hliadkujú bunku, sledujú výskyt akejkoľvek DNA a porovnávajú ju s gRNA. Ak existuje zhoda, dvojitá špirála DNA sa okamžite rozreže na kúsky a inaktivuje. "Akonáhle sme si uvedomili Cas ako programovateľné enzýmy rezajúce DNA, nastal zaujímavý okamih," pripomenula si neskôr Jennifer Dudna. - Vykričali sme: „Bože, toto môže byť nástroj!“
Dnes bola identifikovaná celá rodina proteínov Cas, ale proteín Cas9 izolovaný z baktérií Streptococcus pyogenes, pôvodcov šarlatovej horúčky, sa ukázal byť najviac študovaným a zvládnutým. Bol to on, kto vytvoril základ najnovšej metódy genetickej modifikácie živých organizmov CRISPR / Cas9, metódy, ktorá sľubuje bezprecedentný prielom v biotechnológii, poľnohospodárstve a medicíne.
Palindrómy v DNA: A. Palindrome, B. Ring, C. Stem.
modifikácie
Proteín Cas9 je skutočne nukleáza, to znamená enzým, ktorý štiepi DNA. Pre každú metódu genetickej modifikácie - odstránenie alebo pridanie cielených aktívnych génov do tela - hrá táto schopnosť kľúčovú úlohu. Ak chcete kopírovať a vkladať, musíte vystrihnúť a urobiť to na presne definovanom mieste. Až doteraz mali genetici problémy s presnosťou.
Pamätajme, že molekula DNA je podľa molekulárnych štandardov neuveriteľne dlhý reťazec, ktorého celková dĺžka v každom chromozóme každej z našich buniek dosahuje rádovo centimetrov. Tento polymér sa nelíši v rozmanitosti, pozostáva iba zo štyroch rôznych jednotiek: adenínu (A), guanínu (G), tymínu (T) a cytozínu (C), ktoré sa opakujú milióny a milióny krát. Nájdenie správnej stránky v tejto monotónnosti je neuveriteľne ťažké.
Kryštalická štruktúra S. aureus Cas9 v komplexe so sRNA a jej cieľovou DNA.
Genetici mali už dlho len systémy s nukleázami, ktoré rozpoznávajú krátke oblasti - napríklad štyri nukleotidy ATTSC alebo THCA - z ktorých sa môžu v reťazci vyskytnúť desiatky a stovky. Výsledkom bolo, že kusy boli náhodne uskutočnené z týchto miest a iba starostlivá práca umožnila výber buniek, v ktorých sa tento proces uskutočnil v požadovanej oblasti genómu. Na rozdiel od toho génový proteín Cas9 gRNA rozpoznáva fragment s dĺžkou tejto RNA - asi 20 nukleotidov. Spravidla sa takéto oblasti už neopakujú v DNA ešte vyšších organizmov.
Navyše samotná štruktúra komplexu Cas9 s gRNA určuje ľahkosť práce s ním. Stačí v počítači otvoriť databázu s DNA daného organizmu v počítači, nájsť fragment, ktorý sa musí odrezať, a syntetizovať molekuly gRNA s rovnakou sekvenciou báz (a nahradenie tymínu, ktorého úlohu v RNA hrá uracil, U). Cas9 - nukleázy sú nečitateľné a budú rezať DNA kdekoľvek, pokiaľ sa zhodujú gRNA.
Kryštalická štruktúra Cas9 viazaná na DNA.
Na rozdiel od toho systémy genetickej modifikácie predchádzajúcich generácií vyžadovali zdĺhavú prácu na navrhovaní a syntéze nukleázových enzýmov schopných rozpoznávať špecifické oblasti DNA. Napríklad metódy, ktoré používajú zinkové prsty viažuce sa na DNA, ZFN (zinkový prstový nukleázový proteín) alebo proteíny TALEN (nukleotidový aktivátor podobný transkripčnému aktivátoru), teoreticky umožňujú prácu s ešte dlhšími fragmentmi DNA. Pre každú konkrétnu úlohu však musia byť navrhnuté osobitne.
A nakoniec, CRISPR / Cas9 je univerzálny vo vzťahu k rôznym typom modifikovaných organizmov. Táto metóda je jednoduchá a efektívna a prinajmenšom teoreticky je rovnako vhodná na získanie ryže s vysokým obsahom vitamínu A alebo lososa, ktorý priberá na váhe dvakrát rýchlejšie ako obvykle, na zavedenie nových génov alebo nahradenie chybných génov pri chove koní a ľudí … Ale predtým, ako sa presunie na ľudia, poďme „cvičiť na mačkách“. A lepšie - na myšiach.
Myši, ľudia a všetko - všetko - všetko
Predstavte si, že potrebujeme získať albínové myši, aby sme mohli študovať, ako tento stav ovplyvňuje zdravie rôznych telesných systémov u ľudí. Preto by sa mali vypnúť obe kópie génu spojené so syntézou melanínového pigmentu. Ak sa zaväzujeme k tradičným prístupom ku genetickej modifikácii (mimochodom, väčšinou si tiež požičiavajú od baktérií), mali by sme byť trpezliví.
Na začiatok je potrebné syntetizovať „albínový gén“a získať embryá myší v prvých štádiách vývoja. Potom sa do ich jadier zavedie nová najtenšia dutá sklenená ihla. V deliacich sa bunkách dochádza k rekombinácii - výmene homológnych oblastí chromozómov - takže po trikrát prepláchnutí dúfajme, že zachytí fragment, ktorý potrebujeme. Prostredníctvom pokusu a omylu, nekonečného opakovania a vyradenia môžeme získať myši, ktoré dostali jednu kópiu „albumínu génu“a boli schopné ich preniesť na svojich potomkov. Potom krížením takýchto zvierat skôr či neskôr dosiahneme narodenie jednotlivcov s nahradením obidvoch kópií. Môžete počkať, ale je lepšie okamžite prepnúť na CRISPR / Cas9.
Albino laboratórna myš.
V skutočnosti, aby sa získali rovnaké albínové myši, stačí nájsť hraničné oblasti nášho cieľového génu a syntetizovať pre nich gRNA a potom do embrya zaviesť nový gén spolu s proteínmi Cas9 a DNA. Po vyzdvihnutí gRNA nukleázy Cas9 odrežú obe kópie génu pozdĺž okrajov, po ktorých sú zapojené bunkové opravné systémy zodpovedné za udržiavanie integrity genómu.
Toto je mimoriadne náročná úloha, takže opravné bielkoviny pôsobia rýchlo a dokonca hrubo. Po zistení poškodenia DNA - o to viac nebezpečného ako dvojvláknový rez - sú pripravení vyzdvihnúť prvý kus DNA, ktorý príde, doslova „zaplniť“medzeru. Takže ak je v bunke dostatok fragmentov, budú zabudované do miesta rezaného proteínmi Cas9.
Nie je bez dôvodu, že genetická modifikácia urobila prielom po objavení CRISPR / Cas9. Hlasné vyhlásenie čínskych biológov je iba jedným príkladom. ČĽR zostáva krajinou s jedným z najměkších zákonov v oblasti genetického inžinierstva. Dokonca aj vo Veľkej Británii, kde sú povolené experimenty na použití CRISPR / Cas9 na ľudských embryách, musia byť výsledné chiméry zničené pred dosiahnutím veku 14 dní. V Číne je omnoho viac povolených.
Takéto diela sú neuveriteľne sľubné: doslova v posledných rokoch sa ukázalo, že CRISPR / Cas9 vám umožňuje editovať gény aj v dospelom organizme a odstraňuje DNA T-lymfocytov z HIV, ktorý ich infikoval. A v tej istej Číne sa vedci (nie veľmi úspešne) pokúsili získať embryá odolné voči tejto infekcii. Teraz ide o boj proti rakovine. Na tento účel lekári plánujú upraviť DNA rovnakých T-lymfocytov - presnejšie gén pre proteín PD-1, ktorý ich normálne udržuje pod kontrolou.
T-lymfocytov.
Štruktúra vírusu ľudskej imunodeficiencie.
Aktívny gén PD-1 blokuje schopnosť T lymfocytov napadnúť vlastné bunky tela a bráni rozvoju autoimunitných chorôb. Avšak v prípade rakoviny by táto schopnosť bola veľmi vhodná a vedci odoberú bunky skutočným pacientom s rakovinou a zmenia gén PD-1 pomocou CRISPR / Cas9 (teraz všeobecne chápeme, ako sa to dá urobiť). Vracaním týchto lymfocytov do tela autori očakávajú, že sa rozmnožia a napadnú nádor.
Rakovina a HIV sú len niekoľkými vysokoprofilovými príkladmi. V budúcnosti však CRISPR / Cas9 a genetická modifikácia pomôžu zbaviť sa mnohých ďalších chorôb. Okrem toho sú mnohé z najzávažnejších stavov spojené s prerušením práce iba jedného génu: je zrejmé, že ich bude oveľa ľahšie napraviť ako vyliečiť rovnakú rakovinu. Naopak, láskavosť a inteligencia, krása alebo atletická schopnosť sú výsledkom práce množstva rôznych génov, výchovy a iných faktorov životného prostredia. CRISPR / Cas9 bude teda prínosom iba, ale nie je pravdepodobné, že by sa použil na poškodenie. Je to len vystrašiť.
Komentáre Vasiliev