Vzorky tkanív múmie pod názvami „Maria“a „Vavita“boli zaslané z Peru do ruského laboratória na výskum. Poskytnuté vzorky biologických tkanív boli študované pomocou skenovacej elektrónovej mikroskopie, Ramanovho spektra, ICPE, bolo skúmané zloženie rozsievkovej zeminy (látka na povrchu kože múmií). Uskutočnila sa aj štúdia DNA prenášaných tkanív.
príprava vzorky
Vzorky tkanív, každá po 500 μg, sa preniesli do plastových skúmaviek a rozpustili sa v 1 ml tlmivého roztoku (10 mM Tris-HCI pH = 10,5, 1 mM EDTA, 0,15 M NaCI). K výsledným suspenziám bol pridaný dodecylsulfát sodný na 0,5%, zahrievaný na +80 ° C a po 10 minútach bola proteináza K (do 500 μg / ml) umiestnená na 24 hodín do termostatu (+55 ° C).
Deproteinizácia sa uskutočnila fenolickou metódou: pridanie fenolu v rovnakom objeme k suspenzii, potom fenol: chloroform (1: 1), chloroform; po každom pridaní sa uskutočnilo konštantné miešanie na uhlovom rotore a centrifugácia pri 15 000 ot./min., 10 min.
K super-sedimentu získanému po tretej centrifugácii sa pridalo 1/10 objemu 1 M NaCl a 2,5 objemu dvakrát destilovaného etylalkoholu a zmes sa nechala cez noc pri -30 ° C v kónických skúmavkách - „Eppendorf“. Centrifugácia sa uskutočnila pri 15 000 obj. min. v priebehu 10 minút a dostala DNA „vyzrážanú“vo forme hnedej zrazeniny. Peleta DNA bola premytá dvakrát 70% etylalkoholom a sušená pri teplote miestnosti (1 h) a potom rozpustená v TE tlmivom roztoku.
PCR sa uskutočňovala na programovateľnom termálnom cyklovači "My Cycler" ("Bio = Rad") s použitím štandardných oligoprimérov syntetizovaných metódou v tuhej fáze v asociácii "Beagler" (Petrohrad). Reakčná zmes na amplifikáciu s objemom 25 μl obsahovala: 15 nM každého oligopriméru, 67 mM Tris-HCI pH = 8,8 pri +25 ° C, 16,6 mM (NH4) S04, 6,7 mM MgCl2, 6,7 μM EDTA, 10 mM 2 merkaptoetanol, 170 μg / ml BSA a zmes štyroch základných dNTPs v koncentrácii 1,0 mM a termostabilnej DNA polymerázy Thermus thermophilis (5 U / μl) (NPO SibEnzim). Po denaturácii (10 minút, 94 ° C) sa uskutočnilo 35 amplifikačných cyklov pre každý testovací systém: 94 ° C -1 min, 58 ° C - 1 min, 72 ° C - 1 min. Na kontrolu špecifickosti boli do reakcie zavedené vzorky DNA so známymi genotypmi pre študované miesta (markerové systémy), ako aj kontrolné vzorky.obsahujúci zmes reagencií bez DNA. Po amplifikácii sa k alikvotom reakčnej zmesi (7 μl) pridal farbiaci pufor a separoval sa vertikálnou elektroforézou v 6% polyakrylamidovom géli (210 x 150 x 1 mm), vyfarbil sa etídiumbromidom a fotografoval sa pod ultrafialovým svetlom. Na identifikáciu alel sa použili alelické štandardy zodpovedajúce týmto lokusom („rebríky“).
Propagačné video:
DNA analýza
Na štúdiu sme použili metódu exómovej analýzy ľudskej DNA založenú na vysoko výkonnom sekvencovaní s obohatením hybridizáciou.
Technika exómovej analýzy ľudskej DNA.
Analyzovali sa 2 vzorky … Všetky fázy prípravy vzoriek pred PCR sa uskutočňovali v čistých priestoroch. Príprava vzoriek, extrakcia DNA a amplifikácia jednotlivých fragmentov DNA sa uskutočňovali v rôznych miestnostiach.
Špecifické adaptéry (súprava na prípravu knižnice KAPA a súprava adaptérov SeqCap; Roche) sa ligovali na konce genómovej fragmentovanej DNA (~ 5 ng), potom sa uskutočnil dvojstupňový výber fragmentov v rozsahu dĺžky 200 až 350 bp pomocou perličiek AMPureXP (Beckman Coulter). … Výsledné fragmenty boli amplifikované primérmi špecifickými pre adaptér a hybridizované s biotinylovanými špecifickými sondami (NimbleGen SeqCap EZ Choice MedExome; Roche) počas 28 hodín pri 47 ° C. V jednej reakcii sa spojili dve vzorky DNA. Biotinylované hybridy sonda-DNA boli izolované a purifikované pomocou magnetických častíc konjugovaných so streptovidínom, uskutočnila sa druhá amplifikácia a kvalitatívne vyhodnotenie výslednej DNA knižnice (TapeStation 4200; Agilent Technologies). Aby sa odstránili fragmenty amplifikácie mimo cieľa a diméry adaptérov, DNA knižnica sa prečistila použitím magnetických častíc AMPureXP Beads (obr. 1). Konečná koncentrácia pripravenej knižnice sa vyhodnotila na prístroji Quantus s použitím komerčnej súpravy QuantiFluor® dsDNA System (Promega). Výsledná DNA knižnica bola imobilizovaná na povrch prietokovej bunky. Sekvenovanie sa uskutočnilo na platforme Illumina pomocou štandardného prietokového článku a súpravy MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 x 150 cyklov). Výsledná DNA knižnica bola imobilizovaná na povrch prietokovej bunky. Sekvenovanie sa uskutočnilo na platforme Illumina pomocou štandardného prietokového článku a súpravy MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 x 150 cyklov). Výsledná DNA knižnica bola imobilizovaná na povrch prietokovej bunky. Sekvenovanie sa uskutočnilo na platforme Illumina pomocou štandardného prietokového článku a súpravy MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 x 150 cyklov).
Obrázok: 1
Všeobecné hodnotenie kvality sekvenovanej DNA
Na počiatočné hodnotenie kvality sa použili štandardné metódy, ako napríklad FastQC a programy Medúza a KraTER. Hodnotenie kvality nepreukázalo žiadne problémy s kvalitou sekvencovaných hodnôt DNA pre obe vzorky. Obrázky nie sú zobrazené, pretože nie sú informatívne.
Pre prvú vzorku (ďalšie M, veľká múmia "Maria") sa sekvenovalo 113,4 M čítaní, pre druhú vzorku (ďalšie W, malá múmia "WaWita") sa sekvenovalo 22,9 M čítanie.
Ďalším krokom bolo očistenie sekvenovaných údajov z rôznych technických sekvencií, ktoré by interferovali s ďalšou analýzou. Na tento účel sa použil program Cookiecutter. Po vyčistení boli zistené hodnoty 113,3 M (99%) a 22,8 M (99%) pre M a W.
Odhad množstva starej DNA a jej oddelenie od modernej
Štandardnou metódou na hodnotenie prítomnosti a množstva starej DNA je odhadnúť množstvo časom poškodených nukleotidov. Na tento účel sa použil program MapDamage 2.0. MapDamage 2.0, ktorý ukazoval množstvo starej DNA v 30,1%, ale keďže MapDamage naznačuje, že používame blízky odkaz a nevieme presne, ako blízko sú obe vzorky genómu moderných ľudí a použili sme exómovú knižnicu, táto metóda sama o sebe nebola dostačujúce. Ďalšou dobrou metódou na hodnotenie starodávnej DNA je počet krátkych fragmentov.
Filtrácia údajnej starovekej DNA sa uskutočnila v troch etapách. V prvej fáze sme odstránili všetky spárované čítania, ktoré nemožno krížiť a zostaviť do jedného nepárového čítania s prekrývaním. Tieto čítania naznačujú, že pôvodný fragment, ktorý bol sekvenovaný, bol dlhší ako 300 bp. a pravdepodobne moderná DNA. Takže po tomto kroku zostalo 86,9% a 91,8%. Potom boli jednotlivé prekrývané fragmenty vybrané tak, aby ich dĺžka bola kratšia ako 150 bp, pretože to je dĺžka, ktorú sme očakávali od starej DNA. Po tomto kroku zostalo 8,6% pre vzorky M a W 38,5%. Treba poznamenať, že napriek rozdielu v percentách je absolútny počet odčítaní medzi vzorkami M a W veľmi podobný: 9,8 M a 8,8 M, čo možno vysvetliť skutočnosťou, že obsah starej DNA v oboch vzorkách je podobný.
| parameter | Vzorka M (Maria) | Ukážka W (Wawita) |
| Počet čítaní | 113.3 | 22.8 |
| Percento krátkych fragmentov <300 bp | 86,9% | 91,8% |
|
Percentuálny podiel krátkych fragmentov <150 bp (počet) |
8,6% (9 846 035) |
38,5% (8 813 220) |
|
Percento fragmentov zoradených podľa ľudského genómu (počet) |
2,03% (2 345 084) |
9,65% (2 264 551) |
| Percento fragmentov zarovnaných na ľudský genóm od krátkej <150 bp | 23,8% | 25,6% |
Získanie DNA podobnej referenčnému ľudskému genómu
Výsledná predpokladaná starodávna DNA bola mapovaná na referenčný ľudský genóm pomocou štandardného vyhľadávacieho potrubia pre genómové varianty s použitím BWA, samtoolov a Wcftools.
Navyše iba 23,8% vzorky M a 25,6% bolo úspešne zmapovaných na referenčný genóm moderných ľudí. Zároveň sa pre obidve vzorky nemohlo zmapovať 75% sekvenovaných čítaní na ľudský genóm. Dá sa to vysvetliť kontamináciou a skutočnosťou, že tieto vzorky sa nachádzajú dostatočne ďaleko od genómu moderných ľudí. Zároveň je potrebné mať na pamäti, že sme sekvencovali exómovú knižnicu, a tým minimalizovali kontamináciu bakteriálnej DNA.
Počiatočná prieskumná analýza nespracovaných odčítaní ukázala, že niektoré z nich patrili k opakujúcim sa DNA špecifickým pre kopytníky, čo sa dá vysvetliť skutočnosťou, že pri mumifikácii sa použil lámový tuk.
Podrobnejšia analýza trvá približne tri týždne výpočtov, pretože existujúce riešenia sa robili iba pre vírusové a bakteriálne genómy, a preto musíme porovnávať so všetkými existujúcimi genómami vrátane rastlinných genómov, aby sme pochopili, ktorý druh sa sekvenoval.
Charakteristika nájdených možností
Mapované čítania sa použili na hľadanie variantov, ktoré rozlišujú vzorky M a W od moderného ľudského genómu, ako aj na hodnotenie kontaminácie odčítaní z ľudského Y chromozómu.
Prvou otázkou, na ktorú bolo treba odpovedať, bolo to, na ktoré chromozómy boli sekvenované údaje mapované.
Pretože vieme, že Máriové vzorky boli izolované z kostí a svalov a Vavita iba z kostí, očakávali sme rozdiel v množstve mtDNA. Ale nebol tam žiadny rozdiel.
Počet namapovaných hodnôt na Y je ďalším testom kontaminácie súčasnými ľuďmi. Zaujímavé je, že sa ukázalo, že je to rovnaké v oboch vzorkách.
Štatistika nájdených variantov je uvedená nižšie:
| parametre | Vzorka M (Maria) | Ukážka W (Wawita) |
| Počet nájdených možností | 79957 | 48941 |
| Počet možností na Y | 534 | 541 |
| Počet spoľahlivých možností (viac ako 20 čítaní a viac ako 30 kvality) | 16969 | 6181 |
| Varianty so známym rsid (k dispozícii v databáze výstrižkov) | 5701 | 3089 |
| Všeobecné platné možnosti | 92 | |
| bežné možnosti s rsid | 49 |
Potom bolo možné zodpovedať otázku: sú príbuzní M a W? Odpoveď znie nie.
Zistilo sa iba 49 zodpovedajúcich variantov medzi M a W a 3040, ktoré sa líšia pre varianty so známym rsid. Navyše, možno ide o rôzne typy alebo poddruhy osoby alebo neznámeho stvorenia.
Je zaujímavé, že varianty s chromozómom Y sú rovnaké pre obe vzorky, čo naznačuje kontamináciu tou istou osobou, a že v starej DNA chromozómu Y pravdepodobne ešte stále nie je chromozóm.
Vyhodnotenie podobnosti s existujúcimi sekvenovanými ľudskými genómami z projektu 1000 Human Genome Project
Všimnite si, že toto je iba približná analýza, pretože na presnejšiu analýzu sú potrebné varianty z oblastí genómu pod neutrálnym výberom a máme exómové údaje.
Avšak použitím 5708 variantov pre M alebo 3096 pre S bolo možné vykonať variant analýzy v porovnaní s údajmi o 1000 ľudských genómoch.
Výsledkom analýzy PCA na nasledujúcom obrázku je prekrytie dvoch obrázkov pre M a W, počítané osobitne, pretože medzi M a W je príliš málo bežných možností na odhad vzdialenosti medzi M a W.
Skóre podobnosti.
Ako vidíte, neexistuje žiadna zhoda so žiadnou skupinou génov, líšia sa aj navzájom. Malo by sa však pamätať na to, že sme použili kódujúce sekvencie pod selekciou a odporúča sa používať varianty pod neutrálnym výberom.
Výsledok PCA je napriek tomu v dobrej zhode s ručným overením variantov, ktoré ukázali, že údaje sú v nerozkazovanom homozygote, čo opäť naznačuje, že obrázky sú ďaleko od moderného ľudského genómu.
záver
Bohužiaľ sme boli obmedzení iba na dve vzorky, zvyčajne sa pri tomto type analýzy používa viac, aspoň s trochou aspoň nejako súvisiacich. Preto je potrebné pokračovať vo výskume s veľkým počtom vzoriek.
Zároveň môžeme s najväčšou pravdepodobnosťou dospieť k záveru, že vzorky DNA Márie a Vavity zodpovedajú ľudskej DNA, ale nezhodujú sa s DNA, ktorú máme k dispozícii z databázy 1 000 ľudí.
Autori správy: Baranov V. S. a Aseev M. V. (Vedecký výskumný ústav pôrodníctva a gynekológie, oddelenie prenatálnej diagnostiky), Glotov A. S. a Glotov O. S. (Štátna univerzita v Petrohrade), A. S. Komissarov (Cytologický ústav, Ruská akadémia vied, Centrum pre genetickú bioinformatiku).
Materiály poskytnuté Konstantinom Georgievičom Korotkovom (doktor technických vied, profesor, Univerzita informačných technológií, mechaniky a optiky) a Dmitrijom Vladislavovičom Galetským (kandidát lekárskych vied, I. P. Pavlov 1. Štátna lekárska univerzita v Petrohrade).
Viac informácií o múmach Nazca nájdete v značke: Mumie Nazca.